Un élément important de la recherche en biotechnologie est l'utilisation de techniques d'ingénierie des protéines pour concevoir ou modifier des protéines. Ces techniques de purification des protéines optimisent les propriétés des protéines pour des applications industrielles spécifiques.
Ces techniques nécessitent que les scientifiques isolent et purifient les protéines d'intérêt afin que leurs conformations et spécificités de substrat puissent être étudiées. Les réactions avec d'autres ligands (une protéine qui se fixe à une protéine réceptrice) et les activités enzymatiques spécifiques nécessitent également une étude.
Le degré de pureté protéique requis dépend de l'utilisation finale prévue de la protéine. Pour certaines applications, un extrait brut est suffisant. Pour d'autres utilisations, comme dans les aliments et les produits pharmaceutiques, un haut niveau de pureté est requis. Plusieurs techniques pour purification des protéines sont utilisés pour atteindre le niveau de pureté requis.
Développer une stratégie
Chaque étape de purification des protéines entraîne généralement une certaine perte de produit. Par conséquent, une stratégie idéale de purification des protéines est une stratégie dans laquelle le plus haut niveau de purification est atteint en un minimum d'étapes.
La sélection des étapes à utiliser dépend de la taille, de la charge, de la solubilité et d'autres propriétés de la protéine cible. Les techniques suivantes sont les plus appropriées pour purifier une seule protéine cytosolique.
La purification des complexes de protéines cytosoliques est plus compliquée et nécessite généralement l'application de différentes méthodes.
Préparer un extrait brut
La première étape de purification des protéines intracellulaires (à l'intérieur de la cellule) est la préparation d'un extrait brut. L'extrait contiendra un mélange complexe de toutes les protéines du cytoplasme cellulaire et de quelques macromolécules, cofacteurs et nutriments supplémentaires.
Cet extrait brut peut être utilisé pour certaines applications en biotechnologie. Cependant, si la pureté est un problème, les étapes de purification suivantes doivent être suivies. Les extraits de protéines brutes sont préparés par l'élimination des débris cellulaires générés par la lyse cellulaire, ce qui est réalisé à l'aide de produits chimiques, enzymes, sonication ou une presse française.
Supprimer les débris de l'extrait
Les débris sont éliminés par centrifugation et le surnageant (le liquide au-dessus d'un résidu solide) est récupéré. Des préparations brutes de protéines extracellulaires (en dehors de la cellule) peuvent être obtenues en retirant simplement les cellules par centrifugation.
Certainement biotechnologie applications, il existe une demande pour des enzymes thermostables - des enzymes qui peuvent tolérer des températures élevées sans dénaturer, tout en maintenant une activité spécifique élevée.
Les organismes qui produisent des protéines résistantes à la chaleur sont parfois appelés extrémophiles. Une approche facile pour purifier une protéine résistante à la chaleur consiste à dénaturer les autres protéines du mélange en chauffage, puis refroidissement de la solution (permettant ainsi à l'enzyme thermostable de se reformer ou de se redissoudre, si nécessaire). Les protéines dénaturées peuvent ensuite être éliminées par centrifugation.
Étapes intermédiaires de purification des protéines
Moderne biotechnologies les protocoles profitent souvent des nombreux kits ou méthodes disponibles dans le commerce qui fournissent des solutions toutes faites pour les procédures standard. La purification des protéines est souvent effectuée à l'aide de filtres et de colonnes de filtration sur gel préparées.
Kit de dialyse
Suivez les instructions du kit de dialyse et ajoutez le bon volume de la bonne solution et attendez la durée spécifiée pendant la collecte de l'éluant (le solvant a traversé la colonne) dans un nouveau test tube.
Méthodes chromatographiques
Les méthodes chromatographiques peuvent être appliquées à l'aide de colonnes de paillasse ou d'un équipement HPLC automatisé. La séparation par HPLC peut être effectuée par des méthodes en phase inverse, d'échange d'ions ou d'exclusion de taille, et des échantillons détectés par réseau de diodes ou par technologie laser.
Précipitation
Dans le passé, une deuxième étape courante pour purifier une protéine d'un extrait brut était par précipitation dans une solution à force osmotique élevée (c'est-à-dire des solutions salines). La précipitation des protéines se fait généralement en utilisant du sulfate d'ammonium comme sel. Les acides nucléiques dans l'extrait brut peuvent être éliminés en précipitant des agrégats formés avec du sulfate de streptomycine ou du sulfate de protamine.
La précipitation du sel ne conduit généralement pas à une protéine hautement purifiée mais peut aider à éliminer certaines protéines indésirables dans un mélange et à concentrer l'échantillon. Les sels dans la solution sont ensuite éliminés par dialyse à travers un tube de cellulose poreuse, une filtration ou une chromatographie d'exclusion sur gel.
Différentes protéines précipiteront à différentes concentrations de sulfate d'ammonium. En général, les protéines de poids moléculaire plus élevé précipitent à des concentrations plus faibles de sulfate d'ammonium.
Visualisation des protéines et évaluation de la purification
La chromatographie en phase inverse (RPC) sépare les protéines en fonction de leurs hydrophobités relatives (exclusion des molécules non polaires de l'eau). Cette technique est très sélective mais nécessite l'utilisation de solvants organiques.
Certaines protéines sont dénaturées de façon permanente par les solvants et perdent leur fonctionnalité pendant le RPC. Par conséquent, cette méthode n'est pas recommandée pour toutes les applications, en particulier s'il est nécessaire que la protéine cible conserve son activité.
Échange d'ion
La chromatographie d'échange d'ions fait référence à la séparation des protéines en fonction de la charge. Les colonnes peuvent être préparées pour l'échange d'anions ou l'échange de cations. Les colonnes d'échange d'anions contiennent une phase stationnaire avec une charge positive qui attire les protéines chargées négativement.
Échange de cations et filtration sur gel
Les colonnes d'échange de cations sont les billes inverses, chargées négativement, qui attirent les protéines chargées positivement. L'élution (extraction d'un matériau d'un autre) de la ou des protéines cibles se fait en modifiant le pH la colonne, ce qui entraîne un changement ou une neutralisation des groupes fonctionnels chargés de chaque protéine.
La chromatographie d'exclusion stérique (également connue sous le nom de filtration sur gel) sépare les protéines plus grandes des plus petites car les plus grosses molécules se déplacent plus rapidement à travers le polymère réticulé dans la chromatographie colonne. Les grosses protéines ne rentrent pas dans les pores du polymère alors que les protéines plus petites le font et prennent plus de temps à parcourir la colonne de chromatographie, par une voie moins directe.
L'éluat (le résultat de l'élution) est collecté dans une série de tubes séparant les protéines en fonction du temps d'élution. La filtration sur gel est un outil utile pour concentrer un échantillon de protéines car la protéine cible est collectée dans un volume d'élution plus petit que celui initialement ajouté à la colonne. Des techniques de filtration similaires pourraient être utilisées pendant la production de protéines à grande échelle en raison de leur rentabilité.
Chromatographie d'affinité et électrophorèse
La chromatographie d'affinité est une technique très utile pour le "polissage" ou l'achèvement du processus de purification des protéines. Les billes de la colonne de chromatographie sont réticulées à des ligands qui se lient spécifiquement à la protéine cible.
La protéine est ensuite éliminée de la colonne par rinçage avec une solution contenant des ligands libres. Cette méthode donne les résultats les plus purs et l'activité spécifique la plus élevée par rapport à d'autres techniques.
SDS-PAGE (dodécyl sulfate de sodium utilisé avec l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide) se lie aux protéines en leur donnant une grande charge négative nette. Étant donné que les charges de toutes les protéines sont assez égales, cette méthode les sépare presque entièrement en fonction de la taille.
SDS-PAGE est souvent utilisé pour tester la pureté des protéines après chaque étape d'une série. Au fur et à mesure que les protéines indésirables sont progressivement éliminées du mélange, le nombre de bandes visualisées sur le gel SDS-PAGE est réduit, jusqu'à ce qu'il n'y ait qu'une seule bande représentant la protéine souhaitée.
Immunoblot
L'immunoempreinte est une technique de visualisation des protéines appliquée en combinaison avec la chromatographie d'affinité. Des anticorps pour une protéine spécifique sont utilisés comme ligands sur une colonne de chromatographie d'affinité.
La protéine cible est retenue sur la colonne, puis éliminée par rinçage de la colonne avec une solution saline ou d'autres agents. Les anticorps liés aux marqueurs radioactifs ou aux colorants aident à détecter la protéine cible une fois qu'elle est séparée du reste du mélange.