Les endonucléases de restriction sont une classe de enzyme qui coupent les molécules d'ADN. Chaque enzyme reconnaît des séquences uniques de nucléotides dans un brin d'ADN, généralement d'environ quatre à six paires de bases. Les séquences sont palindromiques en ce que le brin d'ADN complémentaire a la même séquence dans le sens inverse. En d'autres termes, les deux brins d'ADN sont coupés au même endroit.
Où ces enzymes se trouvent
Les enzymes de restriction se trouvent dans de nombreuses souches différentes de bactéries où leur rôle biologique est de participer à la défense cellulaire. Ces enzymes limitent l'ADN étranger (viral) qui pénètre dans les cellules en les détruisant. Les cellules hôtes ont un système de modification-restriction qui méthylate leur propre ADN à des sites spécifiques de leurs enzymes de restriction respectives, les protégeant ainsi du clivage. Plus de 800 enzymes connues ont été découverts qui reconnaissent plus de 100 séquences nucléotidiques différentes.
Types d'enzymes de restriction
Il existe cinq types différents d'enzymes de restriction. Le type I coupe l'ADN à des emplacements aléatoires jusqu'à 1 000 paires de bases ou plus du site de reconnaissance. Le type III coupe à environ 25 paires de bases du site. Ces deux types nécessitent de l'ATP et peuvent être de grandes enzymes avec plusieurs sous-unités. Les enzymes de type II, qui sont principalement utilisées en biotechnologie, coupent l'ADN dans la séquence reconnue sans avoir besoin d'ATP et sont plus petites et plus simples.
Les enzymes de restriction de type II sont nommées en fonction des espèces bactériennes dont elles sont isolées. Par exemple, l'enzyme EcoRI a été isolée de E. coli. La plupart du public connaît E. foyers de coli dans les aliments.
Les enzymes de restriction de type II peuvent générer deux types de coupes différentes selon qu'elles coupent les deux brins au centre de la séquence de reconnaissance ou chaque brin plus près d'une extrémité de la reconnaissance séquence.
L'ancienne coupe va générer des "extrémités franches" sans surplomb de nucléotides. Ce dernier génère des extrémités "collantes" ou "cohésives" car chaque fragment d'ADN résultant a un surplomb qui complète les autres fragments. Les deux sont utiles en génétique moléculaire pour ADN recombinant et les protéines. Cette forme d'ADN se démarque car elle est produite par la ligature (liaison ensemble) de deux ou plusieurs brins différents qui n'étaient pas initialement liés ensemble.
Les enzymes de type IV reconnaissent l'ADN méthylé et les enzymes de type V utilisent des ARN pour couper les séquences sur les organismes envahisseurs qui ne sont pas palindromiques.
Utilisation en biotechnologie
Les enzymes de restriction sont utilisées en biotechnologie pour couper l'ADN en brins plus petits afin d'étudier les différences de longueur des fragments entre les individus. Ceci est appelé polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Ils sont également utilisés pour le clonage de gènes.
Techniques RFLP ont été utilisés pour déterminer que des individus ou des groupes d'individus présentent des différences distinctes dans les séquences de gènes et les schémas de clivage de restriction dans certaines zones du génome. La connaissance de ces domaines uniques est la base de empreinte génétique. Chacune de ces méthodes dépend de l'utilisation de électrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation des fragments d'ADN. Le tampon TBE, composé de base Tris, d'acide borique et d'EDTA, est couramment utilisé pour le gel d'agarose électrophorèse pour examiner les produits d'ADN.
Utilisation dans le clonage
Le clonage nécessite souvent l'insertion d'un gène dans un plasmide, qui est un type de morceau d'ADN. Les enzymes de restriction peuvent aider au processus en raison des surplombs monocaténaires qu'ils laissent lorsqu'ils effectuent des coupes. L'ADN ligase, une enzyme distincte, peut réunir deux molécules d'ADN avec des extrémités correspondantes.
Ainsi, en utilisant des enzymes de restriction avec des enzymes ADN ligase, des morceaux d'ADN de différentes sources peuvent être utilisés pour créer une seule molécule d'ADN.