Comment la réaction en chaîne par polymérase fonctionne pour amplifier les gènes

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de génétique moléculaire permettant de réaliser plusieurs copies d'un gène et fait également partie du processus de séquençage des gènes.

Les copies de gènes sont faites à l'aide d'un échantillon d'ADN, et la technologie est assez bonne pour faire plusieurs copies à partir d'une seule copie du gène trouvé dans l'échantillon. L'amplification par PCR d'un gène pour en faire des millions de copies, permet la détection et l'identification de séquences de gènes à l'aide de techniques visuelles basées sur la taille et la charge (+ ou -) du morceau d'ADN.

Dans des conditions contrôlées, de petits segments d'ADN sont générés par des enzymes appelées ADN polymérases, qui ajoutent des désoxynucléotides complémentaires (dNTP) à un morceau d'ADN connu sous le nom de "modèle". Des morceaux d'ADN encore plus petits, appelés « amorces », sont utilisés comme point de départ pour la polymérase.

Les amorces sont de petits morceaux d'ADN artificiels (oligomères), généralement entre 15 et 30 nucléotides de long. Ils sont fabriqués en connaissant ou en devinant de courtes séquences d'ADN aux extrémités du gène à amplifier. Au cours de la PCR, l'ADN séquencé est chauffé et les doubles brins se séparent. Lors du refroidissement, les amorces se lient à la matrice (appelée recuit) et créent un emplacement pour le début de la polymérase.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été rendue possible par la découverte des thermophiles et des thermophiles. enzymes polymérases (enzymes qui maintiennent l'intégrité structurelle et la fonctionnalité après chauffage à haute températures). Les étapes de la technique PCR sont les suivantes :

• Un mélange est créé, avec des concentrations optimisées de matrice d'ADN, d'enzyme polymérase, d'amorces et de dNTP. La capacité de chauffer le le mélange sans dénaturer l'enzyme permet de dénaturer la double hélice de l'échantillon d'ADN à des températures de l'ordre de 94 degrés Celsius.
• Après la dénaturation, l'échantillon est refroidi à une plage plus modérée, autour de 54 degrés, ce qui facilite l'annelage (liaison) des amorces aux matrices d'ADN simple brin.
• Dans la troisième étape du cycle, l'échantillon est réchauffé à 72 degrés, la température idéale pour la Taq DNA Polymerase, pour l'allongement. Pendant l'élongation, l'ADN polymérase utilise le simple brin d'ADN d'origine comme matrice pour ajouter des dNTP complémentaires aux extrémités 3' de chaque amorce et générer une section d'ADN double brin dans la région du gène d'intérêt.
• Les amorces qui se sont hybridées à des séquences d'ADN qui ne correspondent pas exactement ne restent pas hybridées à 72 degrés, limitant ainsi l'élongation au gène d'intérêt.

Ce processus de dénaturation, d'hybridation et d'élongation est répété plusieurs fois (30-40), augmentant ainsi de façon exponentielle le nombre de copies du gène souhaité dans le mélange. Bien que ce processus soit assez fastidieux s'il est effectué manuellement, les échantillons peuvent être préparés et incubés dans un Thermocycleur programmable, désormais courant dans la plupart des laboratoires moléculaires, et une réaction PCR complète peut être effectuée dans 3-4 heures.

Chaque étape de dénaturation arrête le processus d'élongation du cycle précédent, tronquant ainsi le nouveau brin d'ADN et le maintenant approximativement à la taille du gène souhaité. La durée du cycle d'élongation peut être rallongée ou raccourcie en fonction de la taille du gène d'intérêt, mais éventuellement, grâce à des cycles répétés de PCR, la majorité des modèles seront limités à la taille du gène d'intérêt seul, car ils auront été générés à partir de produits des deux amorces.

Il y a plusieurs différents facteurs de réussite de la PCR qui peut être manipulé pour améliorer les résultats. La méthode la plus largement utilisée pour tester la présence de produit PCR est électrophorèse sur gel d'agarose. Qui est utilisé pour séparer les fragments d'ADN en fonction de la taille et de la charge. Les fragments sont ensuite visualisés à l'aide de colorants ou de radio-isotopes.

Depuis la découverte de la PCR, des ADN polymérases autres que la Taq originale ont été découvertes. Certains d'entre eux ont une meilleure capacité de « relecture » ​​ou sont plus stables à des températures plus élevées, améliorant ainsi la spécificité de la PCR et réduisant les erreurs dues à l'insertion du dNTP incorrect.

Certaines variantes de la PCR ont été conçues pour des applications spécifiques et sont maintenant utilisées régulièrement dans les laboratoires de génétique moléculaire. Certains d'entre eux sont la PCR en temps réel et la PCR à transcriptase inverse. La découverte de la PCR a également conduit au développement du séquençage de l'ADN, empreinte génétique et d'autres techniques moléculaires.