Amplification de l'ADN par réaction en chaîne par polymérase

PCR signifie réaction en chaîne par polymérase, une technique de biologie moléculaire pour amplifier des segments d'ADN, en générant de multiples copies à l'aide d'enzymes d'ADN polymérase dans des conditions contrôlées. Une seule copie d'un segment ou d'un gène d'ADN peut être clonée en millions de copies, ce qui permet la détection à l'aide de colorants et d'autres techniques de visualisation.

Développé en 1983, le processus de PCR a permis de réaliser séquençage ADN et identifier l'ordre des nucléotides dans les gènes individuels. Le procédé utilise le cyclage thermique ou le chauffage et le refroidissement répétés de la réaction pour la fusion et la réplication de l'ADN. Alors que la PCR se poursuit, le «nouvel» ADN est utilisé comme matrice pour la réplication et une réaction en chaîne s'ensuit, amplifiant de façon exponentielle la matrice d'ADN.

Les techniques de PCR sont appliquées dans de nombreux domaines de la biotechnologie, y compris ingénierie des protéines, le clonage, la médecine légale (empreintes génétiques), les tests de paternité, le diagnostic des maladies héréditaires et / ou infectieuses et

En médecine légale, en particulier, la PCR est particulièrement utile car elle amplifie même la plus petite quantité de preuves ADN. La PCR peut également être utilisée pour analyser l'ADN vieux de plusieurs milliers d'années, et ces techniques ont été utilisées pour tout identifier, d'un mammouth vieux de 800 000 ans aux momies du monde entier.

Cette étape n'est nécessaire que pour les ADN polymérases qui nécessitent une PCR à démarrage à chaud. La réaction est chauffée entre 94 et 96 ° C et maintenue pendant 1 à 9 minutes.

Si la procédure ne nécessite pas d'initialisation, la dénaturation est la première étape. La réaction est chauffée à 94-98 ° C pendant 20-30 secondes. Les liaisons hydrogène de la matrice d'ADN sont interrompues et des molécules d'ADN simple brin sont créées.

La température de réaction est inférieure entre 50 et 65 ° C et maintenue pendant 20 à 40 secondes. Les amorces s'hybrident à la matrice d'ADN simple brin. La température est extrêmement importante lors de cette étape. S'il fait trop chaud, l'apprêt risque de ne pas se lier. S'il fait trop froid, l'apprêt risque de se lier imparfaitement. Une bonne liaison est formée lorsque la séquence d'amorce correspond étroitement à la séquence de matrice.

La température au cours de cette étape varie en fonction du type de polymérase. L'ADN polymérase synthétise un brin d'ADN complètement nouveau.

Cette étape est effectuée à 70-74 ° C pendant 5 à 15 minutes après le dernier cycle de PCR.

Cette étape est facultative. La température est maintenue à 4-15 ° C et stoppe la réaction.

À chaque cycle, le produit (le morceau spécifique d'ADN qui est répliqué) est doublé.

À mesure que l'ADN polymérase perd son activité et consomme des réactifs, la réaction ralentit.

Plus aucun produit ne s'accumule.