Le domaine de biotechnologie est un changement constant. La croissance et le développement rapides de la recherche de pointe dépendent de l'innovation et de la créativité des scientifiques et leur capacité à voir le potentiel d’une technique moléculaire de base et à l’appliquer à de processus. L'avènement de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a ouvert de nombreuses portes à la recherche génétique, y compris un Analyse ADN et l'identification de différents gènes sur la base de leurs séquences d'ADN. Le séquençage de l'ADN dépend également de notre capacité à utiliser électrophorèse sur gel pour séparer des brins d'ADN qui diffèrent en taille par aussi peu qu'une paire de bases.
Séquençage ADN
À la fin des années 1970, deux techniques de séquençage d'ADN pour des molécules d'ADN plus longues ont été inventées: la méthode Sanger (ou didésoxy) et la méthode Maxam-Gilbert (clivage chimique). La méthode Maxam-Gilbert est basée sur le clivage spécifique des nucléotides par des produits chimiques et est mieux utilisée pour séquencer les oligonucléotides (polymères nucléotidiques courts, généralement inférieurs à 50 paires de bases de longueur). La méthode Sanger est plus couramment utilisée car elle s'est avérée techniquement plus facile à appliquer et, avec l'avènement de la PCR et de l'automatisation de la technique, est facilement applicable à de longs brins d'ADN, y compris certains les gènes. Cette technique est basée sur la terminaison de chaîne par les didésoxynucléotides lors des réactions d'élongation PCR.
Méthode Sanger
Dans la méthode Sanger, le brin d'ADN à analyser est utilisé comme matrice et l'ADN polymérase est utilisée, dans une réaction de PCR, pour générer des brins complémentaires à l'aide d'amorces. Quatre mélanges de réaction de PCR différents sont préparés, chacun contenant un certain pourcentage d'analogues de didésoxynucléoside triphosphate (ddNTP) à l'un des quatre nucléotides (ATP, CTP, GTP ou TTP).
La synthèse du nouveau brin d'ADN se poursuit jusqu'à ce que l'un de ces analogues soit incorporé, moment auquel le brin est tronqué prématurément. Chaque réaction de PCR finira par contenir un mélange de différentes longueurs de brins d'ADN, tous se terminant par le nucléotide qui a été marqué au didésoxy pour cette réaction. Gel électrophorèse est ensuite utilisé pour séparer les brins des quatre réactions, dans quatre voies distinctes, et déterminer la séquence de la matrice d'origine en fonction de la longueur des brins se terminant par quel nucléotide.
Dans la réaction automatisée de Sanger, des amorces sont utilisées qui sont marquées avec quatre étiquettes fluorescentes de couleurs différentes. Les réactions de PCR, en présence des différents didésoxynucléotides, sont effectuées comme décrit ci-dessus. Cependant, ensuite, les quatre mélanges réactionnels sont ensuite combinés et appliqués à une seule voie d'un gel. La couleur de chaque fragment est détectée à l'aide d'un faisceau laser et les informations sont collectées par un ordinateur qui génère des chromatogrammes montrant des pics pour chaque couleur, à partir desquels la séquence d'ADN matrice peut être déterminé.
En règle générale, la méthode de séquençage automatisé n'est précise que pour des séquences jusqu'à un maximum d'environ 700 à 800 paires de bases de longueur. Cependant, il est possible d'obtenir des séquences complètes de gènes plus gros et, en fait, des génomes entiers, en utilisant des méthodes par étapes telles que le séquençage de l'amorce et le fusil de chasse.
Dans Primer Walking, une partie exploitable d'un gène plus gros est séquencée en utilisant la méthode Sanger. De nouvelles amorces sont générées à partir d'un segment fiable de la séquence et utilisées pour continuer à séquencer la partie du gène qui était hors de portée des réactions originales.
Le séquençage du fusil de chasse implique de couper au hasard le segment d'ADN d'intérêt en plus approprié des fragments de taille (gérable), séquençant chaque fragment et organisant les morceaux en fonction du chevauchement séquences. Cette technique a été facilitée par l'application d'un logiciel informatique pour disposer les pièces qui se chevauchent.